Криовиалиобикновено се използват за криогенно съхранение на клетъчни линии и други критични биологични материали в съдове на Дюар, пълни с течен азот.

Има няколко етапа, включени в успешното запазване на клетките в течен азот. Докато основният принцип е бавно замразяване, точната използвана техника зависи от типа клетка и използвания криопротектор. Има няколко съображения за безопасност и най-добри практики, които трябва да се вземат предвид при съхранение на клетки при толкова ниски температури.

Тази публикация има за цел да даде преглед на това как криовиалите се съхраняват в течен азот.

Какво представляват криовиалите

Криовиалите са малки флакони с капачка, предназначени за съхранение на течни проби при изключително ниски температури. Те гарантират, че клетките, запазени в криопротектор, не влизат в директен контакт с течния азот, минимизирайки риска от клетъчни фрактури, като същевременно се възползват от екстремния охлаждащ ефект на течния азот.

Флаконите обикновено се предлагат в различни обеми и дизайни – те могат да бъдат с вътрешна или външна резба с плоско или заоблено дъно. Предлагат се също стерилни и нестерилни формати.

Кой използваCyrovialsза съхраняване на клетки в течен азот

Редица NHS и частни лаборатории, както и изследователски институции, специализирани в банкиране на кръв от пъпна връв, биология на епителните клетки, имунология и биология на стволови клетки, използват криостъкло за криоконсервиране на клетки.

Клетките, запазени по този начин, включват В и Т клетки, СНО клетки, хематопоетични стволови и прогениторни клетки, хибридоми, чревни клетки, макрофаги, мезенхимни стволови и прогениторни клетки, моноцити, миелома, NK клетки и плурипотентни стволови клетки.

Общ преглед на това как да съхранявате криовиалите в течен азот

Криоконсервацията е процес, който запазва клетки и други биологични конструкции чрез охлаждането им до много ниски температури. Клетките могат да се съхраняват в течен азот в продължение на години без загуба на жизнеспособност на клетките. Това е кратко описание на използваните процедури.

Подготовка на клетките

Точният метод за приготвяне на проби ще варира в зависимост от типа клетка, но като цяло клетките се събират и центрофугират, за да се получи богата на клетки пелета. Тази пелета след това се ресуспендира в супернатантата, смесена с криопротектор или среда за криоконсервация.

Криоконсервираща среда

Тази среда се използва за запазване на клетките в нискотемпературните среди, на които ще бъдат подложени, като инхибира образуването на вътрешно- и извънклетъчни кристали и следователно клетъчната смърт. Тяхната роля е да осигурят безопасна, защитна среда за клетките и тъканите по време на процесите на замразяване, съхранение и размразяване.

Среда като прясно замразена плазма (FFP), разтвор на хепаринизиран плазмалит или разтвори без серум и животински компоненти се смесва с криопротектори като диметилсулфоксид (DMSO) или глицерол.

Повторно втечнената утайка от пробата се разпределя на аликвотни части в полипропиленови криовиали като напрБиомедицинска компания Suzhou Ace Криогенни флакони за съхранение.

Важно е да не препълвате криовиалите, тъй като това ще увеличи риска от напукване и възможно освобождаване на съдържанието (1).

Контролирана скорост на замразяване

Като цяло, за успешното криоконсервиране на клетките се използва бавна контролирана скорост на замразяване.

След като пробите се разделят на аликвотни части в криогенни флакони, те се поставят върху мокър лед или в хладилник при 4 ℃ и процедурата на замразяване започва в рамките на 5 минути. Като общо ръководство, клетките се охлаждат със скорост от -1 до -3 на минута (2). Това се постига с помощта на програмируем охладител или чрез поставяне на флакони в изолирана кутия, поставена във фризер с контролирана скорост от –70°C до –90°C.

Прехвърлете в течен азот

След това замразените криогенни флакони се прехвърлят в резервоар с течен азот за неопределен период от време, при условие че се поддържа температура под -135 ℃.

Тези ултраниски температури могат да бъдат постигнати чрез потапяне в течна или парна фаза на азот.

Течна или парна фаза?

Известно е, че съхранението в течна фаза на азот поддържа ниската температура с абсолютна консистенция, но често не се препоръчва поради следните причини:

• Необходимостта от големи обеми (дълбочина) течен азот, което е потенциална опасност. Изгаряния или задушаване поради това е реален риск.
• Документирани случаи на кръстосано заразяване от инфекциозни агенти като аспергилус, хепатит В и вирусно разпространение чрез среда с течен азот (2,3)
• Възможност за изтичане на течен азот във флаконите по време на потапяне. Когато се извади от склада и се затопли до стайна температура, азотът бързо се разширява. Следователно, флаконът може да се счупи, когато се извади от хранилището за течен азот, създавайки опасност както от летящи отломки, така и от излагане на съдържанието (1, 4).

Поради тези причини съхранението при ултраниски температури е най-често в азотна фаза на пари. Когато пробите трябва да се съхраняват в течна фаза, трябва да се използва специализирана cryoflex тръба.

Недостатъкът на парната фаза е, че може да възникне вертикален температурен градиент, водещ до температурни колебания между -135 ℃ и -190 ℃. Това налага внимателно и щателно наблюдение на нивата на течния азот и температурните промени (5).

Много производители препоръчват криофилиите да са подходящи за съхранение до -135 ℃ или за използване само в парна фаза.

Размразяване на вашите криоконсервирани клетки

Процедурата на размразяване е стресираща за замразена култура и е необходимо правилно боравене и техника, за да се осигури оптимална жизнеспособност, възстановяване и функционалност на клетките. Точните протоколи за размразяване ще зависят от специфичните типове клетки. Бързото размразяване обаче се счита за стандарт за:

• Намалете всяко въздействие върху клетъчното възстановяване
• Помогнете за намаляване на времето на излагане на разтворените вещества, присъстващи в средата за замразяване
• Минимизирайте всякакви щети чрез рекристализация на лед

За размразяване на проби обикновено се използват водни бани, вани с перли или специализирани автоматизирани инструменти.

Най-често 1 клетъчна линия се размразява наведнъж за 1-2 минути, като внимателно се разбърква във водна баня при 37 ℃, докато във флакона остане съвсем малко лед, преди да се измият в предварително загрята среда за растеж.

За някои клетки като ембриони на бозайници бавното затопляне е от съществено значение за оцеляването им.

Клетките вече са готови за клетъчна култура, клетъчна изолация или в случай на хемопоетични стволови клетки – изследвания на жизнеспособността, за да се гарантира целостта на донорните стволови клетки преди миелоаблативна терапия.

Нормална практика е да се вземат малки аликвоти от предварително измитата проба, използвана за извършване на клетъчно преброяване, за да се определят клетъчните концентрации за посяване в култура. След това можете да оцените резултатите от процедурите за изолиране на клетки и да определите жизнеспособността на клетките.

Най-добри практики за съхранение на криовиали

Успешното криоконсервиране на проби, съхранявани в криовиали, зависи от много елементи в протокола, включително правилно съхранение и водене на записи.

• Разделете клетките между местата за съхранение– Ако обемите позволяват, разделете клетките между флаконите и ги съхранявайте на отделни места, за да намалите риска от загуба на проба поради повреда на оборудването.
• Предотвратете кръстосано замърсяване– Изберете стерилни криогенни флакони за еднократна употреба или автоклав преди последваща употреба
• Използвайте флакони с подходящ размер за вашите клетки– флаконите се предлагат в различни обеми между 1 и 5 ml. Избягвайте препълването на флаконите, за да намалите риска от напукване.
• Изберете криогенни флакони с вътрешна или външна резба– Флакони с вътрешна резба се препоръчват от някои университети за мерки за безопасност – те също могат да предотвратят замърсяване по време на пълнене или когато се съхраняват в течния азот.
• Предотвратяване на изтичане- Използвайте двойно инжектирани уплътнения, формовани в винтовата капачка или О-пръстените, за да предотвратите изтичане и замърсяване.
• Използвайте 2D баркодове и етикетирайте флаконите– за да се осигури проследимост, флаконите с големи площи за писане позволяват всеки флакон да бъде подходящо етикетиран. 2D баркодовете могат да помогнат при управлението на съхранението и воденето на записи. Капачките с цветен код са полезни за по-лесно разпознаване.
• Адекватна поддръжка на складовете- За да се гарантира, че клетките не се губят, съдовете за съхранение трябва постоянно да следят температурата и нивата на течен азот. Трябва да се монтират аларми, които да предупреждават потребителите за грешки.

Мерки за безопасност

Течният азот се превърна в обичайна практика в съвременните изследвания, но крие риск от сериозно нараняване, ако се използва неправилно.

Трябва да се носят подходящи лични предпазни средства (ЛПС), за да се сведе до минимум рискът от измръзване, изгаряния и други неблагоприятни инциденти при работа с течен азот. Носете

• Криогенни ръкавици
• Лабораторно палто
• Удароустойчив щит за цялото лице, който покрива и врата
• Затворени обувки
• Пръскоустойчива пластмасова престилка

Хладилниците с течен азот трябва да се поставят на добре проветриви места, за да се сведе до минимум рискът от задушаване – изпуснатият азот се изпарява и измества атмосферния кислород. Магазините с голям обем трябва да имат алармени системи с ниско съдържание на кислород.

Работата по двойки при работа с течен азот е идеална и използването му извън нормалното работно време трябва да бъде забранено.

Криовиали в подкрепа на вашия работен процес

Компанията Suzhou Ace Biomedical предлага богат избор от продукти, които отговарят на вашите нужди за криоконсервация за различни видове клетки. Портфолиото включва набор от тръби, както и набор от стерилни криовиали.

Нашите криовиали са:

• Лабораторна винтова капачка 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Криовиални криогенни флакони Криоепруветка с конично дъно и уплътнение

  ● 0.5ml,1.5ml,2.0ml спецификация, с пола или без пола
  ● Предлагат се коничен или самостоятелен дизайн, стерилен или нестерилен
  ● Тубите с винтова капачка са изработени от медицински полипропилен
  ● Флаконите PP Cryotube могат многократно да се замразяват и размразяват
  ● Дизайнът на външната капачка може да намали вероятността от замърсяване по време на обработката на пробата.
  ● Криогенни тръби с винтова капачка Универсални винтови резби за употреба
  ● Тръбите пасват на повечето обикновени ротори
  ● Тръбите с о-пръстен за криогенни тръби пасват на стандартни 1-инчови и 2-инчови, 48 ямки, 81 ямки, 96 ямки и 100 ямки фризерни кутии
  ● Автоклавируем до 121°C и замразяващ до -86°C

  ЧАСТ NO	МАТЕРИАЛ	ОБЕМ	CAPЦВЯТ	PCS/ЧАНТА	ЧАНТИ/КАЛЪФ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Черно, жълто, синьо, червено, лилаво, бяло	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 мл	Черно, жълто, синьо, червено, лилаво, бяло	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Черно, жълто, синьо, червено, лилаво, бяло	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	Черно, жълто, синьо, червено, лилаво, бяло	500	10