Стандартизирането на процесите включва тяхното оптимизиране и последващо установяване и хармонизиране, позволяващо дългосрочно оптимално изпълнение – независимо от потребителя. Стандартизацията гарантира висококачествени резултати, както и тяхната възпроизводимост и сравнимост.
Целта на (класическия) PCR е генерирането на надежден и възпроизводим резултат. За определени приложения, добивът наPCR продуктсъщо е от значение. За тези реакции трябва да се внимава, за да се гарантира, че пробите не са компрометирани и че PCR работният процес остава стабилен. По-конкретно, това означава минимизиране на въвеждането на замърсявания, които биха могли да доведат до фалшиво положителни или фалшиво отрицателни резултати или дори да инхибират PCR реакцията. Освен това реакционните условия трябва да бъдат възможно най-идентични за всяка отделна проба в рамките на серия и също така да могат да се прехвърлят към последващи реакции (на същия метод). Това се отнася до състава на реакциите, както и до типа контрол на температурата в циклера. Потребителските грешки, разбира се, трябва да се избягват, доколкото е възможно.
По-долу ще демонстрираме предизвикателствата, които срещаме по време на подготовката и по време на провеждането на PCR – и подходите към решенията, които съществуват по отношение на инструментите и консумативите, използвани за стандартизиране на работните процеси на PCR.
Подготовка на реакцията
Разпределението на реакционните компоненти в PCR-съдове, или съответно плаки, включва множество предизвикателства, които трябва да бъдат преодолени:
Условия на реакцията
Точното и прецизно дозиране на отделните компоненти е необходимо, когато се цели възможно най-еднакви условия на реакция. В допълнение към добрата техника на пипетиране, изборът на правилния инструмент е от решаващо значение. PCR главните смеси често съдържат вещества, които повишават вискозитета или образуват пяна. По време на процеса на пипетиране те водят до значително намокряне нанакрайници за пипети, като по този начин се намалява точността на пипетиране. Използването на системи за директно дозиране или алтернативни накрайници за пипети, които са по-малко склонни към намокряне, може да подобри точността и прецизността на процеса на пипетиране.
Замърсявания
По време на процеса на дозиране се генерират аерозоли, които, ако се оставят да достигнат вътрешността на пипетата, могат потенциално да замърсят друга проба по време на следващата стъпка на пипетиране. Това може да се предотврати чрез използване на филтърни накрайници или системи с директно изместване.
Консумативи катосъвети, съдовете и плаките, които се използват в работния процес на PCR, не трябва да съдържат вещества, които компрометират пробата или фалшифицират резултата. Те включват ДНК, ДНКази, РНКази и PCR инхибитори, както и компоненти, които потенциално могат да се отделят от материала по време на реакцията – вещества, известни като извличащи се.
Потребителска грешка
Колкото повече проби се обработват, толкова по-голям е рискът от грешка. Лесно може да се случи проба да бъде пипетирана в грешен съд или грешна ямка. Този риск може да бъде значително намален чрез лесно забележима маркировка на кладенците. Чрез автоматизирането на етапите на дозиране „човешкият фактор“, т.е. грешките и свързаните с потребителя вариации, са сведени до минимум, като по този начин се увеличава възпроизводимостта, особено в случай на малки реакционни обеми. Това изисква плочи с достатъчна стабилност на размерите, за да бъдат използвани в работна станция. Приложените баркодове осигуряват допълнителна машинна четимост, което опростява проследяването на пробите през целия процес.
Програмиране на термоциклера
Програмирането на инструмент може да се окаже отнемащо време, както и податливо на грешки. Различните функции на PCR термоциклера работят заедно, за да опростят тази стъпка на процеса и, най-важното, да я направят безопасна:
Лесната работа и доброто ръководство за потребителя са в основата на ефективното програмиране. Надграждайки тази основа, защитеното с парола потребителско администриране ще предотврати нечии собствени програми да бъдат променяни от други потребители. Ако се използват няколко циклера (от един и същи тип), е полезно програмата да може да се прехвърля директно от един инструмент на друг чрез USB или връзка. Компютърният софтуер позволява централно и сигурно администриране на програми, потребителски права и документи на компютър.
PCR изпълнение
По време на цикъла ДНК се амплифицира в реакционния съд, където всяка проба трябва да бъде подложена на идентични, последователни реакционни условия. Следните аспекти са от значение за процеса:
Контрол на температурата
Отличната точност в контрола на температурата и хомогенността на циклиращия блок са в основата на равномерното температурно кондициониране на всички проби. Високото качество на нагревателните и охлаждащи елементи (пелтие елементи), както и начинът, по който те са свързани към блока, са решаващите фактори, които ще определят риска от температурни несъответствия, известни като "ефект на ръба"
Изпарение
Концентрациите на отделните реакционни компоненти не трябва да се променят по време на реакцията поради изпаряване. В противен случай е възможно много малкоPCR продуктмогат да бъдат генерирани или никакви. Поради това е изключително важно да се сведе до минимум изпарението, като се осигури сигурно уплътнение. В този случай нагрятият капак на термоциклера и уплътнението на съда работят ръка за ръка. Предлагат се различни опции за уплътняванеPCR плаки (връзка: Статия за запечатване), при което най-доброто запечатване се постига чрез топлинно запечатване. Други затваряния също могат да бъдат подходящи, стига контактното налягане на капака на циклера да може да се регулира спрямо избраното уплътнение.
Въведена е стандартизация на процесите, за да се гарантират точни и възпроизводими резултати в дългосрочен план. Това включва редовна поддръжка на оборудването, за да се гарантира, че винаги е в добро работно състояние. Всички консумативи трябва да бъдат с постоянно високо качество във всички произведени партиди и тяхната надеждна наличност трябва да бъде гарантирана.
Време на публикуване: 29 ноември 2022 г