Въведение
Какво е екстракция на нуклеинова киселина?
Най-просто казано, екстракцията на нуклеинова киселина е отстраняването на РНК и/или ДНК от проба и целия излишък, който не е необходим. Процесът на екстракция изолира нуклеиновите киселини от пробата и ги дава под формата на концентриран елуат, без разредители и замърсители, които биха могли да повлияят на всяко приложение надолу по веригата.
Приложения на екстракция на нуклеинова киселина
Пречистените нуклеинови киселини се използват в множество различни приложения, вариращи в множество различни индустрии. Здравеопазването е може би областта, в която се използва най-много, с пречистена РНК и ДНК, необходими за множество различни или различни цели на тестване.
Приложенията на извличане на нуклеинова киселина в здравеопазването включват:
- Секвениране от следващо поколение (NGS)
- Базирано на амплификация SNP генотипиране
- Генотипиране на базата на масив
- Рестрикционно ензимно храносмилане
- Анализи с помощта на модифициращи ензими (напр. лигиране и клониране)
Има и други области извън здравеопазването, където се използва екстракция на нуклеинова киселина, включително, но не само, тестове за бащинство, криминалистика и геномика.
Кратка история на екстракцията на нуклеинова киселина
Екстракция на ДНКдатира отдавна, като първото известно изолиране е извършено от швейцарски лекар на име Фридрих Мишер през 1869 г. Мишер се надяваше да разреши основните принципи на живота чрез определяне на химичния състав на клетките. След като се провали с лимфоцитите, той успя да получи груба утайка от ДНК от левкоцити, намерени в гной върху изхвърлени превръзки. Той направи това, като добави киселина и след това основа към клетката, за да напусне цитоплазмата на клетката, и след това разработи протокол за отделяне на ДНК от другите протеини.
След новаторските изследвания на Miescher много други учени напреднаха и разработиха техники за изолиране и пречистване на ДНК. Едуин Джоузеф Кон, протеинов учен, разработва много техники за пречистване на протеини по време на Втората световна война. Той е отговорен за изолирането на серумната албуминова фракция на кръвната плазма, която е важна за поддържане на осмотичното налягане в кръвоносните съдове. Това беше от решаващо значение за запазването на войниците живи.
През 1953 г. Франсис Крик, заедно с Розалинд Франклин и Джеймс Уотсън, определят структурата на ДНК, показвайки, че тя е изградена от две вериги от дълги вериги от нуклеотиди на нуклеинова киселина. Това революционно откритие проправи пътя за Meselson и Stahl, които успяха да разработят протокол за центрофугиране с градиент на плътност, за да изолират ДНК от бактерии E. Coli, докато демонстрираха полуконсервативната репликация на ДНК по време на своя експеримент от 1958 г.
Техники за извличане на нуклеинова киселина
Какви са 4-те етапа на извличане на ДНК?
Всички методи за извличане се свеждат до едни и същи основни стъпки.
Разрушаване на клетките. Този етап, известен също като клетъчен лизис, включва разрушаване на клетъчната стена и/или клетъчната мембрана, за да се освободят вътреклетъчните течности, съдържащи интересуващите ни нуклеинови киселини.
Премахване на нежелани отпадъци. Това включва мембранни липиди, протеини и други нежелани нуклеинови киселини, които могат да попречат на приложенията надолу по веригата.
Изолация. Има редица различни начини за изолиране на интересуващите ни нуклеинови киселини от изчистения лизат, който сте създали, които попадат между две основни категории: базирани на разтвор или в твърдо състояние (вижте следващия раздел).
Концентрация. След като нуклеиновите киселини са изолирани от всички други замърсители и разредители, те се представят във високо концентриран елуат.
Двата вида екстракция
Има два вида екстракция на нуклеинова киселина – методи, базирани на разтвор, и методи в твърдо състояние. Методът, базиран на разтвор, е известен също като метод на химическа екстракция, тъй като включва използване на химикали за разграждане на клетката и достъп до нуклеиновия материал. Това може да се използва или с органични съединения като фенол и хлороформ, или с по-малко вредни и следователно по-препоръчителни неорганични съединения като протеиназа К или силикагел.
Примери за различни методи за химическа екстракция за разграждане на клетка включват:
- Осмотично разкъсване на мембраната
- Ензимно смилане на клетъчната стена
- Разтваряне на мембраната
- С препарати
- С алкална обработка
Техниките в твърдо състояние, известни също като механични методи, включват използване на това как ДНК взаимодейства с твърд субстрат. Чрез избиране на зрънце или молекула, към която ДНК ще се свърже, но аналита не, е възможно да се разделят двете. Примери за техники за екстракция на твърда фаза, включително използване на силициев диоксид и магнитни перли.
Обяснено извличане на магнитни перли
Методът за извличане на магнитни перли
Потенциалът за извличане с помощта на магнитни мъниста беше признат за първи път в американски патент, подаден от Тревър Хокинс, за изследователската институция на Института Уайтхед. Този патент признава, че е възможно да се извлече генетичен материал чрез свързването му към твърд опорен носител, който може да бъде магнитно зърно. Принципът е, че използвате силно функционално магнитно зърно, върху което ще се свърже генетичният материал, който след това може да бъде отделен от супернатантата чрез прилагане на магнитна сила към външната страна на съда, съдържащ пробата.
Защо да използваме екстракция с магнитни перли?
Технологията за извличане на магнитни перли става все по-разпространена поради потенциала, който притежава за бързи и ефективни процедури за извличане. В последно време има разработки на силно функционализирани магнитни перли с подходящи буферни системи, които направиха възможна автоматизация на екстракцията на нуклеинови киселини и работен процес, който е много лек и рентабилен. Освен това методите за екстракция с магнитни перли не включват стъпките на центрофугиране, които могат да причинят сили на срязване, които разрушават по-дълги части от ДНК. Това означава, че по-дългите нишки на ДНК остават непокътнати, което е важно при геномните тестове.
Време на публикуване: 25 ноември 2022 г