Криопробиркизвычайна выкарыстоўваюцца для крыягеннага захоўвання клеткавых ліній і іншых важных біялагічных матэрыялаў у ёмістасцях Дьюара, напоўненых вадкім азотам.

Ёсць некалькі этапаў паспяховага захавання клетак у вадкім азоце. Хоць асноўным прынцыпам з'яўляецца павольнае замарожванне, дакладны метад залежыць ад тыпу клетак і крыяпратэктара, які выкарыстоўваецца. Пры захоўванні клетак пры такіх нізкіх тэмпературах варта ўлічваць некалькі мер бяспекі і перадавых практык.

Мэта гэтага паведамлення - даць агляд таго, як крыяпрабіркі захоўваюцца ў вадкім азоце.

Што такое криопробирки

Криопробирки - гэта невялікія флаконы з вечкам, прызначаныя для захоўвання вадкіх узораў пры вельмі нізкіх тэмпературах. Яны гарантуюць, што клеткі, захаваныя ў крыяпратэктары, не ўступаюць у непасрэдны кантакт з вадкім азотам, зводзячы да мінімуму рызыку клеткавых пераломаў, у той жа час карыстаючыся надзвычайным астуджальным эфектам вадкага азоту.

Флаконы звычайна даступныя ў розных аб'ёмах і канструкцыях - яны могуць мець унутраную або вонкавую разьбу з плоскім або закругленым дном. Таксама даступныя стэрыльныя і нестэрыльныя фарматы.

Хто выкарыстоўваеЦыравіялызахоўваць клеткі ў вадкім азоце

Шэраг NHS і прыватных лабараторый, а таксама даследчых устаноў, якія спецыялізуюцца на захоўванні пупавіннай крыві, біялогіі эпітэліяльных клетак, імуналогіі і біялогіі ствалавых клетак, выкарыстоўваюць крыяпрабіркі для крыякансервавання клетак.

Клеткі, захаваныя такім чынам, уключаюць В- і Т-клеткі, клеткі СНО, гемопоэтические ствалавыя клеткі і клеткі-папярэднікі, гібрыдомы, клеткі кішачніка, макрафагі, мезенхімальныя ствалавыя клеткі і клеткі-папярэднікі, манацыты, міелому, клеткі NK і плюрыпатэнтныя ствалавыя клеткі.

Агляд таго, як захоўваць криопробирки ў вадкім азоце

Крыякансервацыя - гэта працэс, які захоўвае клеткі і іншыя біялагічныя канструкцыі шляхам іх астуджэння да вельмі нізкіх тэмператур. Клеткі могуць захоўвацца ў вадкім азоце гадамі без страты жыццяздольнасці клетак. Гэта схема выкарыстоўваных працэдур.

Падрыхтоўка клетак

Дакладны метад падрыхтоўкі ўзораў будзе вар'іравацца ў залежнасці ад тыпу клетак, але ў цэлым клеткі збіраюць і цэнтрыфугуюць для атрымання багатага клеткамі асадка. Затым гэты асадак ресуспендируют ў супернатанте, змешаным з криопротектором або асяроддзем для криоконсервации.

Асяроддзе для крыякансервацыі

Гэта асяроддзе выкарыстоўваецца для захавання клетак пры нізкай тэмпературы, якой яны будуць падвяргацца, шляхам інгібіравання адукацыі ўнутры- і пазаклеткавых крышталяў і, такім чынам, гібелі клетак. Іх роля заключаецца ў забеспячэнні бяспечнага, ахоўнага асяроддзя для клетак і тканак падчас працэсаў замарожвання, захоўвання і адтавання.

Такое асяроддзе, як свежазамарожаная плазма (СЗП), гепарынізаваны раствор плазмаліту або бессыроватачныя растворы без кампанентаў жывёл, змешваюць з крыяпратэктарамі, такімі як дыметылсульфаксід (ДМСО) або гліцэрына.

Асадак паўторна звадкаванага ўзору размяркоўваюць у поліпрапіленавыя криопробирки, такія якКампанія Suzhou Ace Biomedical Cryogenic Storage Vials.

Важна не перапаўняць криопробирки, бо гэта павялічвае рызыку парэпання і магчымага выкіду змесціва (1).

Кантраляваная хуткасць замарожвання

Увогуле, для паспяховай криоконсервации клетак выкарыстоўваецца павольная кантраляваная хуткасць замарожвання.

Пасля таго, як узоры размяркоўваюць у крыягенныя флаконы, іх змяшчаюць на мокры лёд або ў халадзільнік з тэмпературай 4 ℃ і на працягу 5 хвілін пачынаюць працэдуру замарожвання. Як правіла, клеткі астуджаюць з хуткасцю ад -1 да -3 у хвіліну (2). Гэта дасягаецца з дапамогай праграмуемага ахаладжальніка або шляхам размяшчэння флаконаў у ізаляванай скрынцы, змешчанай у маразільную камеру з кантраляванай хуткасцю ад -70 °C да -90 °C.

Перанесці ў вадкі азот

Замарожаныя крыягенныя флаконы затым пераносяцца ў рэзервуар з вадкім азотам на нявызначаны перыяд часу пры ўмове падтрымання тэмпературы ніжэй за -135 ℃.

Гэтыя звышнізкія тэмпературы можна атрымаць шляхам апускання ў вадкую або паравую фазу азоту.

Вадкая або паравая фаза?

Вядома, што захоўванне ў вадкай фазе азоту падтрымлівае халодную тэмпературу з абсалютнай кансістэнцыяй, але часта не рэкамендуецца па наступных прычынах:

• Патрэба ў вялікіх аб'ёмах (глыбіні) вадкага азоту, што з'яўляецца патэнцыйнай небяспекай. Апёкі або асфіксія з-за гэтага - рэальная небяспека.
• Задакументаваныя выпадкі перакрыжаванага заражэння інфекцыйнымі агентамі, такімі як аспергіллез, гепатыт В і вірусы, якія распаўсюджваюцца праз асяроддзе з вадкім азотам (2,3)
• Магчымасць уцечкі вадкага азоту ў флаконы падчас апускання. Калі выняць са сховішча і нагрэць да пакаёвай тэмпературы, азот хутка пашыраецца. Такім чынам, флакон можа разбіцца, калі яго выняць са сховішча вадкага азоту, што стварае небяспеку як з-за лятучага смецця, так і ад уздзеяння змесціва (1, 4).

Па гэтых прычынах захоўванне пры звышнізкай тэмпературы часцей за ўсё адбываецца ў паравой фазе азоту. Калі ўзоры неабходна захоўваць у вадкай фазе, варта выкарыстоўваць спецыялізаваныя трубкі cryoflex.

Адваротным бокам паравой фазы з'яўляецца тое, што можа адбыцца вертыкальны градыент тэмпературы, які прыводзіць да ваганняў тэмпературы паміж -135 ℃ і -190 ℃. Гэта патрабуе ўважлівага і стараннага кантролю за ўзроўнямі вадкага азоту і тэмпературнымі зменамі (5).

Многія вытворцы рэкамендуюць, каб крыяпрабіркі былі прыдатныя для захоўвання пры тэмпературы да -135 ℃ або для выкарыстання толькі ў паравой фазе.

Размарожванне крыякансерваваных клетак

Працэдура размарожвання з'яўляецца стрэсам для замарожанай культуры, таму для забеспячэння аптымальнай жыццяздольнасці, аднаўлення і функцыянальнасці клетак патрабуецца належнае абыходжанне і тэхніка. Дакладныя пратаколы размарожвання будуць залежаць ад канкрэтных тыпаў клетак. Аднак хуткае адтаванне лічыцца стандартным для:

• Паменшыць любы ўплыў на аднаўленне клетак
• Дапамажыце скараціць час уздзеяння раствораных рэчываў, якія прысутнічаюць у замарожваючых асяроддзях
• Мінімізуйце любую шкоду шляхам перакрышталізацыі лёду

Для размарожвання ўзораў звычайна выкарыстоўваюцца вадзяныя лазні, ванны з шарыкамі або спецыяльныя аўтаматызаваныя прыборы.

Часцей за ўсё 1 клетачную лінію размарожваюць на працягу 1-2 хвілін, асцярожна паварочваючы на ​​вадзяной лазні пры 37 ℃, пакуль у флаконе не застанецца крыху лёду, перш чым яны прамываюцца ў папярэдне разагрэтай асяроддзі для росту.

Для некаторых клетак, такіх як эмбрыёны млекакормячых, павольнае награванне неабходна для іх выжывання.

Цяпер клеткі гатовыя для культывавання клетак, ізаляцыі клетак або, у выпадку крывятворных ствалавых клетак, для даследавання жыццяздольнасці, каб гарантаваць цэласнасць донарскіх ствалавых клетак перад міелааблатыўнай тэрапіяй.

Нармальнай практыкай з'яўляецца адбор невялікіх порцый папярэдне прамытага ўзору, які выкарыстоўваецца для падліку клетак для вызначэння канцэнтрацыі клетак для пасева ў культуры. Затым вы можаце ацаніць вынікі працэдур ізаляцыі клетак і вызначыць іх жыццяздольнасць.

Лепшыя практыкі захоўвання криопробирок

Паспяховая крыякансервацыя узораў, якія захоўваюцца ў крыяпрабірках, залежыць ад многіх элементаў пратаколу, уключаючы належнае захоўванне і вядзенне дакументацыі.

• Падзяліць ячэйкі паміж месцамі захоўвання– Калі дазваляюць аб’ёмы, падзяліце клеткі паміж флаконамі і захоўвайце іх у асобных месцах, каб знізіць рызыку страты ўзору з-за няспраўнасці абсталявання.
• Прадухіліць перакрыжаванае заражэнне– Выбірайце аднаразовыя стэрыльныя крыягенныя флаконы або аўтаклаў перад наступным выкарыстаннем
• Выкарыстоўвайце флаконы адпаведнага памеру для вашых клетак- флаконы бываюць у дыяпазоне аб'ёмаў ад 1 да 5 мл. Пазбягайце перапаўнення флаконаў, каб знізіць рызыку парэпання.
• Выберыце крыягенныя флаконы з унутранай або вонкавай разьбой– Некаторыя ўніверсітэты рэкамендуюць флаконы з унутранай разьбой для мер бяспекі – яны таксама могуць прадухіліць забруджванне падчас напаўнення або пры захоўванні ў вадкім азоце.
• Прадухіліць уцечку- Для прадухілення ўцечкі і забруджвання выкарыстоўвайце ўшчыльняльнікі з двума ўпырсканнямі, адлітыя ў закручвальны каўпачок або ўшчыльняльныя кольцы.
• Выкарыстоўвайце 2D штрых-коды і маркіруйце флаконы– каб забяспечыць адсочванне, флаконы з вялікімі абласцямі для напісання дазваляюць нанесці адпаведную этыкетку на кожны флакон. Двухмерныя штрых-коды могуць дапамагчы ў кіраванні сховішчам і вядзенні дакументацыі. Крышкі з каляровым кодам карысныя для палягчэння ідэнтыфікацыі.
• Належнае абслугоўванне захоўвання- Каб клеткі не былі страчаны, у ёмістасцях для захоўвання неабходна пастаянна кантраляваць тэмпературу і ўзровень вадкага азоту. Павінна быць ўстаноўлена сігналізацыя, каб папярэджваць карыстальнікаў аб памылках.

Тэхніка бяспекі

Вадкі азот стаў звычайнай практыкай у сучасных даследаваннях, але нясе рызыку сур'ёзных траўмаў пры няправільным выкарыстанні.

Каб звесці да мінімуму рызыку абмаражэння, апёкаў і іншых неспрыяльных інцыдэнтаў пры працы з вадкім азотам, трэба насіць належныя сродкі індывідуальнай абароны (СІЗ). Насіць

• Крыягенныя пальчаткі
• Лабараторны халат
• Ударатрывалы шчыток на ўвесь твар, які таксама закрывае шыю
• Туфлі з закрытым носам
• Брызгозащищенный пластыкавы фартух

Халадзільнікі з вадкім азотам варта размяшчаць у памяшканнях з добрай вентыляцыяй, каб мінімізаваць рызыку асфіксіі - азот, які вылучаецца, выпараецца і выцясняе атмасферны кісларод. Вялікія крамы павінны мець сістэмы сігналізацыі з нізкім узроўнем кіслароду.

Праца ў пары пры працы з вадкім азотам з'яўляецца ідэальнай, і яго выкарыстанне па-за звычайным працоўным часам павінна быць забаронена.

Криопробирки для падтрымкі вашага працоўнага працэсу

Кампанія Suzhou Ace Biomedical прапануе шырокі выбар прадуктаў, якія адпавядаюць вашым патрэбам у крыякансервацыі розных тыпаў клетак. Партфель уключае шэраг трубак, а таксама шэраг стэрыльных крыяпрабірак.

Нашы криопробирки:

• Лабараторная шрубавая вечка 0,5 мл 1,5 мл 2,0 мл крыяпрабіркі з крыягеннымі флаконамі з канічным дном і пракладкай

  ● 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл спецыфікацыі, з спадніцай або без спадніцы
  ● Даступны канічны або самастойны дызайн, стэрыльны або нестэрыльны
  ● Прабіркі з шрубавым каўпачком зроблены з поліпрапілена медыцынскага класа
  ● флаконы PP Cryotube можна шматразова замарожваць і размарожваць
  ●Канструкцыя вонкавага каўпачка можа знізіць верагоднасць заражэння падчас апрацоўкі ўзору.
  ● Крыягенныя трубкі з шрубавым каўпачком Універсальная шрубавая разьба для выкарыстання
  ● Трубы падыходзяць да большасці звычайных ротараў
  ● Крыягенныя трубкі з ушчыльняльнымі кольцамі падыходзяць да стандартных 1-цалевых і 2-цалевых маразільных скрынак на 48, 81, 96 і 100-лункавых камер.
  ● Аўтаклавуецца да 121°C і замарожваецца да -86°C

  ЧАСТКА NO	МАТЭРЫЯЛ	АБ'ЁМ	КАПКАКОЛЕР	шт./СУМКА	СУМКА/ЧАХАЛ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Чорны, жоўты, сіні, чырвоны, фіялетавы, белы	500	10
  АКТ15-БЛ-Н	PP	1,5 мл	Чорны, жоўты, сіні, чырвоны, фіялетавы, белы	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Чорны, жоўты, сіні, чырвоны, фіялетавы, белы	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 мл	Чорны, жоўты, сіні, чырвоны, фіялетавы, белы	500	10