Уводзіны
Што такое экстракцыя нуклеінавых кіслот?
Прасцей кажучы, экстракцыя нуклеінавай кіслаты - гэта выдаленне РНК і/або ДНК з узору і ўсяго лішняга, што не з'яўляецца неабходным. Працэс экстракцыі вылучае нуклеінавыя кіслоты з узору і дае іх у выглядзе канцэнтраванага элюата, вольнага ад разбаўляльнікаў і забруджванняў, якія могуць паўплываць на любыя далейшыя праграмы.
Прымяненне экстракцыі нуклеінавых кіслот
Вычышчаныя нуклеінавыя кіслоты выкарыстоўваюцца ў розных галінах прамысловасці. Ахова здароўя - гэта, магчыма, тая сфера, дзе ён выкарыстоўваецца больш за ўсё, бо вычышчаныя РНК і ДНК неабходныя для мноства розных мэтаў тэсціравання.
Прымяненне экстракцыі нуклеінавых кіслот у ахове здароўя ўключае:
- Паслядоўнасць наступнага пакалення (NGS)
- Генатыпаванне SNP на аснове ампліфікацыі
- Генатыпаванне на аснове масіва
- Абмежаванне ферментаў стрававання
- Аналіз з выкарыстаннем мадыфікуючых ферментаў (напрыклад, перавязка і кланаванне)
Акрамя аховы здароўя, ёсць і іншыя сферы, у якіх выкарыстоўваецца экстракцыя нуклеінавых кіслот, уключаючы, але не абмяжоўваючыся імі, тэставанне на бацькоўства, крыміналістыку і геноміку.
Кароткая гісторыя экстракцыі нуклеінавых кіслот
Вылучэнне ДНКбярэ свой пачатак вельмі даўно: першае вядомае вылучэнне было выканана швейцарскім лекарам Фрыдрыхам Мішэрам у 1869 годзе. Мішэр спадзяваўся раскрыць фундаментальныя прынцыпы жыцця, вызначыўшы хімічны склад клетак. Пасля няўдачы з лімфацытамі ён змог атрымаць грубы асадак ДНК з лейкацытаў, знойдзеных у гноі на выкінутых бінтах. Ён зрабіў гэта, дадаўшы кіслату, а затым шчолач у клетку, каб пакінуць цытаплазму клеткі, а затым распрацаваў пратакол для аддзялення ДНК ад іншых бялкоў.
Пасля наватарскіх даследаванняў Мішэра многія іншыя навукоўцы пайшлі наперад і распрацавалі метады ізаляцыі і ачысткі ДНК. Эдвін Джозэф Кон, навуковец па бялку, распрацаваў шмат метадаў ачысткі бялку падчас Другой сусветнай вайны. Ён адказваў за вылучэнне сыроватачна-альбумінавай фракцыі плазмы крыві, важнай для падтрымання асматычнага ціску ў сасудах. Гэта было вырашальна для захавання жыцця салдат.
У 1953 годзе Фрэнсіс Крык разам з Разаліндай Франклін і Джэймсам Уотсанам вызначылі структуру ДНК, паказаўшы, што яна складаецца з двух нітак доўгіх ланцугоў нуклеатыдаў нуклеінавых кіслот. Гэта прарыўнае адкрыццё адкрыла шлях для Мезельсана і Шталя, якія змаглі распрацаваць пратакол цэнтрыфугавання ў градыенце шчыльнасці для вылучэння ДНК з бактэрый кішачнай палачкі, калі яны прадэманстравалі напаўкансерватыўную рэплікацыю ДНК падчас эксперыменту 1958 года.
Метады экстракцыі нуклеінавых кіслот
Якія 4 стадыі экстракцыі ДНК?
Усе метады здабычы зводзяцца да аднолькавых фундаментальных крокаў.
Разбурэнне клетак. Гэтая стадыя, таксама вядомая як лізіс клетак, уключае разбурэнне клеткавай сценкі і/або клеткавай мембраны з мэтай вызвалення ўнутрыклеткавай вадкасці, якая змяшчае цікавыя нуклеінавыя кіслоты.
Выдаленне непажаданага смецця. Гэта ўключае ў сябе мембранныя ліпіды, вавёркі і іншыя непажаданыя нуклеінавыя кіслоты, якія могуць перашкаджаць прымяненню ніжэй па плыні.
Ізаляцыя. Ёсць некалькі розных спосабаў вылучэння цікавых нуклеінавых кіслот з створанага вамі ачышчанага лізата, якія падпадаюць пад дзве асноўныя катэгорыі: на аснове раствора або ў цвёрдым стане (гл. наступны раздзел).
Канцэнтрацыя. Пасля таго, як нуклеінавыя кіслоты былі выдзелены з усіх іншых забруджванняў і разбаўляльнікаў, яны прадстаўлены ў высокаканцэнтраваным элюаце.
Два тыпу здабычы
Ёсць два тыпу экстракцыі нуклеінавых кіслот - метады на аснове раствора і метады цвёрдага стану. Метад, заснаваны на рашэнні, таксама вядомы як метад хімічнай экстракцыі, паколькі ён уключае выкарыстанне хімічных рэчываў для разбурэння клеткі і доступу да нуклеінавага матэрыялу. Гэта можа быць выкарыстанне арганічных злучэнняў, такіх як фенол і хлараформ, або менш шкодных і, такім чынам, больш рэкамендуемых неарганічных злучэнняў, такіх як пратэіназа K або силикагель.
Прыклады розных метадаў хімічнай экстракцыі для разбурэння клеткі ўключаюць:
- Асматычны разрыў мембраны
- Ферментатыўнае пераварванне клеткавай сценкі
- Солюбилизация мембраны
— З мыйнымі сродкамі
- Пры апрацоўцы шчолаччу
Цвёрдацельныя метады, таксама вядомыя як механічныя метады, уключаюць выкарыстанне ўзаемадзеяння ДНК з цвёрдым субстратам. Выбраўшы шарык або малекулу, з якой будзе звязвацца ДНК, а аналіт - не, можна раздзяліць іх. Прыклады метадаў экстракцыі цвёрдай фазы, уключаючы выкарыстанне дыяксіду крэмнія і магнітных шарыкаў.
Тлумачэнне здабычы магнітных шарыкаў
Метад здабывання магнітных шарыкаў
Патэнцыял экстракцыі з выкарыстаннем магнітных шарыкаў быў упершыню прызнаны ў патэнце ЗША, пададзеным Трэварам Хокінсам для даследчай установы Інстытута Уайтхеда. Гэты патэнт пацвярджае магчымасць здабывання генетычнага матэрыялу шляхам прывязкі яго да цвёрдага носьбіта, якім можа быць магнітная шарыка. Прынцып заключаецца ў тым, што вы выкарыстоўваеце высокафункцыяналізаваныя магнітныя шарыкі, на якія звязваецца генетычны матэрыял, які потым можна аддзяліць ад супернатанту шляхам прымянення магнітнай сілы да вонкавага боку пасудзіны, у якой знаходзіцца ўзор.
Навошта выкарыстоўваць магнітную экстракцыю шарыкаў?
Тэхналогія экстракцыі магнітных шарыкаў становіцца ўсё больш распаўсюджанай з-за патэнцыялу для хуткай і эфектыўнай працэдуры экстракцыі. У апошні час былі распрацаваны высокафункцыяналізаваныя магнітныя шарыкі з адпаведнымі буфернымі сістэмамі, якія зрабілі магчымай аўтаматызацыю экстракцыі нуклеінавых кіслот і працоўны працэс, які з'яўляецца вельмі лёгкім і эканамічна эфектыўным. Акрамя таго, метады экстракцыі магнітных шарыкаў не ўключаюць этапы цэнтрыфугавання, якія могуць выклікаць сілы зруху, якія разбіваюць больш доўгія фрагменты ДНК. Гэта азначае, што больш доўгія ланцугі ДНК застаюцца некранутымі, што важна пры тэсціраванні геномікі.
Час публікацыі: 25 лістапада 2022 г