Нягледзячы на тое, што тэарэтычна, адна малекула шаблону будзе дастатковай, значна большая колькасць ДНК звычайна выкарыстоўваецца для класічнай ПЦР, напрыклад, да 1 мкг геномнай ДНК млекакормячых і ўсяго 1 пг плазміднай ДНК. Аптымальная колькасць у значнай ступені залежыць ад колькасці копій мэтавай паслядоўнасці, а таксама ад яго складанасці.
Калі выкарыстоўваецца вельмі мала шаблона, для атрымання дастатковай колькасці прадукту спатрэбіцца адпаведнае павелічэнне колькасці цыклаў узмацнення. Палімераза TAQ, якая выкарыстоўваецца для большасці эксперыментаў з ПЦР, не мае функцыі карэкцыі (3'-5 'актыўнасць экзонуклеазы); Такім чынам, памылкі, якія ўзнікаюць падчас узмацнення, нельга выправіць. Чым вышэй колькасць цыклаў, тым больш распаўсюджана будзе ўзмацненне недапрацаванага прадукту. Калі, з іншага боку, колькасць шаблона занадта высокая, верагоднасць адпалу пра праймеры да іншых (не сто адсоткаў бясплатных) паслядоўнасцей, а таксама фарміраванне дымераў праймераў, што прывядзе да ўзмацнення ўзмацнення абмацавання пабочныя прадукты. У многіх выпадках ДНК вылучаецца з клеткавых культур альбо з мікраарганізмаў і ў далейшым выкарыстоўваецца ў якасці шаблону ПЦР. Пасля ачышчэння неабходна вызначыць канцэнтрацыю ДНК, каб мець магчымасць вызначыць аб'ём, неабходны для ўстаноўкі ПЦР. Хоць электрафарэз агарозы гель можа служыць для ацэнкі, гэты метад далёкі ад дакладнага. УФ-VIS-спектрафатаметрыя была ўстаноўлена як залаты стандарт для колькаснага вызначэння нуклеінавых кіслот; Гэты прамы і таму просты і хуткі метад вымярае паглынанне ўзору пры 260 нм, а канцэнтрацыя разлічваецца пры дапамозе каэфіцыента пераўтварэння.
Калі канцэнтрацыя ДНК вельмі нізкая, аднак (<1 мкг/мл dsDNA), альбо калі яна забруджаная рэчывамі, якія таксама паглынаюць у дыяпазоне 260 нм (напрыклад, РНК, бялок, солі), гэты метад дасягне яго абмежаванняў. У выпадку з вельмі нізкімі канцэнтрацыямі паказанні ў хуткім часе стануць занадта недакладнымі, каб выкарыстоўваць, а забруджванне прывядзе да (часам велізарнай) завышэння фактычнага значэння. У гэтым выпадку колькаснае вызначэнне з выкарыстаннем флуарэсцэнцыі можа прадстаўляць альтэрнатыву. Гэтая методыка заснавана на выкарыстанні флуарэсцэнтнага фарбавальніка, які звязвае спецыяльна з dsDNA, толькі комплекс, які ўключае нуклеінавую кіслату і фарбавальнік, узбуджаецца святлом, і ў далейшым будзе выкідваць святло крыху больш высокай даўжыні хвалі. Тут інтэнсіўнасць флуарэсцэнтнага сігналу прапарцыйная колькасці ДНК, і для вызначэння канцэнтрацыі яна ацэньваецца ў адносінах да стандартнай крывой. Перавагі гэтага метаду абапіраюцца на спецыфіку сувязі, якая выключае знешнія ўплывы, унесеныя за кошт забруджвання, а таксама на атрыманую здольнасць выяўляць вельмі нізкія канцэнтрацыі ДНК. Прыдатнасць любога метаду залежыць у асноўным ад канцэнтрацыі ўзору і чысціні; У многіх выпадках можа быць нават мэтазгодна прымяняць абодва спосабу паралельна.
Час паведамлення: 30-2022