Giriş
Nuklein turşularının çıxarılması nədir?
Ən sadə dillə desək, nuklein turşusunun çıxarılması nümunədən RNT və/yaxud DNT-nin və lazım olmayan bütün artıqlığın çıxarılmasıdır. Ekstraksiya prosesi nuklein turşularını nümunədən təcrid edir və onları aşağı axın tətbiqlərinə təsir edə biləcək seyrelticilərdən və çirkləndiricilərdən təmizlənmiş konsentratlı eluat şəklində verir.
Nuklein turşularının çıxarılmasının tətbiqləri
Təmizlənmiş nuklein turşuları bir çox müxtəlif sənaye sahələrində müxtəlif tətbiqlərdə istifadə olunur. Səhiyyə bəlkə də ən çox istifadə edilən sahədir, təmizlənmiş RNT və DNT müxtəlif müxtəlif test məqsədləri üçün tələb olunur.
Səhiyyədə nuklein turşusu ekstraksiyasının tətbiqi aşağıdakıları əhatə edir:
- Next Generation Sequencing (NGS)
- Amplification-based SNP Genotyping
- Massiv əsaslı genotipləşdirmə
- Həzm fermentinin məhdudlaşdırılması
- Dəyişdirici fermentlərdən istifadə edərək təhlillər (məs: Liqasiya və Klonlaşdırma)
Atalıq testi, məhkəmə ekspertizası və genomika da daxil olmaqla, lakin bununla məhdudlaşmayaraq, nuklein turşusunun ekstraksiyasının istifadə edildiyi səhiyyədən başqa digər sahələr də var.
Nuklein turşularının çıxarılmasının qısa tarixi
DNT çıxarılması1869-cu ildə İsveçrə həkimi Fridrix Mişer tərəfindən məlum olan ilk təcridetmə üsulu uzun müddət əvvələ gedib çıxır. Miescher hüceyrələrin kimyəvi tərkibini təyin etməklə həyatın əsas prinsiplərini həll etməyə ümid edirdi. Limfositlərlə uğursuzluqdan sonra, atılmış sarğılarda irində olan leykositlərdən DNT-nin xam çöküntüsünü əldə edə bildi. Hüceyrənin sitoplazmasını tərk etmək üçün hüceyrəyə turşu və sonra qələvi əlavə edərək bunu etdi və sonra DNT-ni digər zülallardan ayırmaq üçün protokol hazırladı.
Miescherin əsaslı tədqiqatından sonra bir çox digər elm adamları DNT-ni təcrid etmək və təmizləmək üçün texnikaları inkişaf etdirməyə və inkişaf etdirməyə davam etdilər. Protein alimi Edvin Cozef Kon İkinci Dünya Müharibəsi zamanı zülalların təmizlənməsi üçün bir çox üsul inkişaf etdirdi. O, qan damarlarında osmotik təzyiqin saxlanmasında vacib olan qan plazmasının serum albumin fraksiyasının təcrid olunmasına cavabdeh idi. Bu, əsgərlərin sağ qalması üçün çox vacib idi.
1953-cü ildə Francis Crick, Rosalind Franklin və James Watson ilə birlikdə DNT-nin quruluşunu təyin edərək, onun nuklein turşusu nukleotidlərinin uzun zəncirlərinin iki zəncirindən ibarət olduğunu göstərdi. Bu sıçrayışlı kəşf, 1958-ci ildə apardıqları təcrübə zamanı DNT-nin yarı konservativ replikasiyasını nümayiş etdirərək E.Coli bakteriyasından DNT-ni təcrid etmək üçün sıxlıq qradiyenti sentrifuqalama protokolunu inkişaf etdirməyi bacaran Meselson və Stahl üçün yol açdı.
Nuklein turşularının çıxarılması üsulları
DNT ekstraksiyasının 4 mərhələsi hansılardır?
Bütün hasilat üsulları eyni əsas addımlara qədər qaynayır.
Hüceyrənin pozulması. Hüceyrə lizisi kimi də tanınan bu mərhələ, maraq doğuran nuklein turşularını ehtiva edən hüceyrədaxili mayelərin sərbəst buraxılması üçün hüceyrə divarının və/və ya hüceyrə membranının parçalanmasını əhatə edir.
Arzuolunmaz zibillərin çıxarılması. Buraya membran lipidləri, zülallar və aşağı axın tətbiqlərinə müdaxilə edə bilən digər arzuolunmaz nuklein turşuları daxildir.
İzolə. Yaratdığınız təmizlənmiş lizatdan maraq doğuran nuklein turşularını təcrid etməyin bir sıra müxtəlif yolları var, bunlar iki əsas kateqoriya arasındadır: məhlul əsaslı və ya bərk hal (növbəti hissəyə baxın).
Konsentrasiya. Nuklein turşuları bütün digər çirkləndiricilərdən və seyrelticilərdən təcrid edildikdən sonra onlar yüksək konsentrasiyalı eluatda təqdim edilir.
Çıxarmanın iki növü
Nuklein turşusunun çıxarılmasının iki növü var - məhlul əsaslı üsullar və bərk hal üsulları. Həll əsaslı üsul kimyəvi çıxarma üsulu kimi də tanınır, çünki hüceyrəni parçalamaq və nüvə materialına daxil olmaq üçün kimyəvi maddələrdən istifadə etməyi nəzərdə tutur. Bu, ya fenol və xloroform kimi üzvi birləşmələrdən, ya da daha az zərərli və buna görə də Proteinaz K və ya silika gel kimi daha çox tövsiyə olunan qeyri-üzvi birləşmələrdən istifadə edilə bilər.
Hüceyrənin parçalanması üçün müxtəlif kimyəvi ekstraksiya üsullarına nümunələr bunlardır:
- membranın osmotik qırılması
- Hüceyrə divarının fermentativ həzmi
- membranın həll edilməsi
- Yuyucu vasitələrlə
- Qələvi müalicəsi ilə
Mexanik üsullar kimi də tanınan bərk hal üsulları, DNT-nin bərk substratla necə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu istismar etməyi əhatə edir. DNT-nin bağlanacağı, lakin analitin bağlanmayacağı bir muncuq və ya molekul seçməklə, ikisini ayırmaq mümkündür. Silisium və maqnit muncuqlardan istifadə də daxil olmaqla bərk fazalı ekstraksiya üsullarının nümunələri.
Maqnetik muncuqların çıxarılması izah edildi
Maqnetik muncuqların çıxarılması üsulu
Maqnit muncuqlardan istifadə edərək ekstraksiya potensialı ilk dəfə Trevor Hawkins tərəfindən Whitehead İnstitutunun tədqiqat institutu üçün təqdim etdiyi ABŞ patentində tanındı. Bu patent, genetik materialı maqnit muncuq ola biləcək möhkəm bir dəstək daşıyıcısına bağlayaraq çıxarmağın mümkün olduğunu etiraf etdi. Prinsip ondan ibarətdir ki, siz genetik materialın bağlanacağı yüksək funksionallaşdırılmış maqnit muncuqdan istifadə edirsiniz, daha sonra nümunəni tutan qabın kənarına maqnit qüvvəsi tətbiq etməklə supernatantdan ayrıla bilərsiniz.
Niyə Maqnetik Boncuk Ekstraksiyasından istifadə edin?
Maqnit muncuq çıxarma texnologiyası sürətli və səmərəli çıxarma prosedurları üçün malik olduğu potensiala görə getdikcə geniş yayılmaqdadır. Son zamanlarda nuklein turşusunun çıxarılmasının avtomatlaşdırılmasını və çox resurs yüngül və qənaətcil iş axınını mümkün edən uyğun tampon sistemləri ilə yüksək funksionallaşdırılmış maqnit muncuqların inkişafı olmuşdur. Həmçinin, maqnit muncuq çıxarma üsulları DNT-nin daha uzun hissələrini parçalayan kəsmə qüvvələrinə səbəb ola biləcək mərkəzdənqaçma addımlarını əhatə etmir. Bu, DNT-nin daha uzun zəncirlərinin toxunulmaz qalması deməkdir ki, bu da genomik testlərdə vacibdir.
Göndərmə vaxtı: 25 noyabr 2022-ci il