كريوفيالستُستخدم عادةً للتخزين المبرد لخطوط الخلايا وغيرها من المواد البيولوجية المهمة، في ديوار مملوءة بالنيتروجين السائل.

هناك عدة مراحل تشارك في الحفاظ الناجح على الخلايا في النيتروجين السائل. في حين أن المبدأ الأساسي هو التجميد البطيء، فإن التقنية المستخدمة تعتمد على نوع الخلية والمادة الواقية من البرد المستخدمة. هناك العديد من اعتبارات السلامة وأفضل الممارسات التي يجب مراعاتها عند تخزين الخلايا في درجات الحرارة المنخفضة هذه.

يهدف هذا المنشور إلى تقديم لمحة عامة عن كيفية تخزين وحدات التبريد في النيتروجين السائل.

ما هي كريوفيالز

Cryovials عبارة عن قوارير صغيرة مغطاة مصممة لتخزين العينات السائلة في درجات حرارة منخفضة للغاية. إنها تضمن أن الخلايا المحفوظة في المادة الواقية من البرد لا تتلامس بشكل مباشر مع النيتروجين السائل، مما يقلل من خطر الكسور الخلوية بينما لا تزال تستفيد من تأثير التبريد الشديد للنيتروجين السائل.

تتوفر القوارير عادة في مجموعة من الأحجام والتصميمات - يمكن أن تكون مترابطة داخليًا أو خارجيًا مع قيعان مسطحة أو مستديرة. تتوفر أيضًا تنسيقات معقمة وغير معقمة.

من يستخدمالسيروفياللتخزين الخلايا في النيتروجين السائل

تستخدم مجموعة من المختبرات التابعة لهيئة الخدمات الصحية الوطنية والمختبرات الخاصة، بالإضافة إلى المؤسسات البحثية المتخصصة في بنوك دم الحبل السري، وبيولوجيا الخلايا الظهارية، وعلم المناعة، وبيولوجيا الخلايا الجذعية، أجهزة التبريد لحفظ الخلايا بالتبريد.

تشمل الخلايا المحفوظة بهذه الطريقة الخلايا B وT، وخلايا CHO، والخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية، والأورام الهجينة، والخلايا المعوية، والبلاعم، والخلايا الجذعية الوسيطة والخلايا السلفية، والخلايا الوحيدة، والورم النقوي، والخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا الجذعية متعددة القدرات.

نظرة عامة على كيفية تخزين Cryovials في النيتروجين السائل

الحفظ بالتبريد هو عملية تحافظ على الخلايا والتركيبات البيولوجية الأخرى عن طريق تبريدها إلى درجات حرارة منخفضة جدًا. يمكن تخزين الخلايا في النيتروجين السائل لسنوات دون فقدان قدرتها على البقاء. وهذا ملخص للإجراءات المستخدمة.

تحضير الخلية

ستختلف الطريقة الدقيقة لإعداد العينات اعتمادًا على نوع الخلية، ولكن بشكل عام، يتم جمع الخلايا وطردها مركزيًا لتطوير حبيبات غنية بالخلايا. يتم بعد ذلك إعادة تعليق هذه الحبيبات في المادة الطافية الممزوجة بمادة الحماية بالتبريد أو وسط الحفظ بالتبريد.

وسيلة الحفظ بالتبريد

يتم استخدام هذه الوسيلة للحفاظ على الخلايا في البيئات ذات درجات الحرارة المنخفضة التي ستتعرض لها عن طريق تثبيط تكوين البلورات داخل وخارج الخلية وبالتالي موت الخلايا. ويتمثل دورها في توفير بيئة آمنة وقائية للخلايا والأنسجة أثناء عمليات التجميد والتخزين والذوبان.

يتم خلط وسط مثل البلازما الطازجة المجمدة (FFP)، أو محلول البلازماليت الهيبارين أو المحاليل الخالية من المكونات الحيوانية مع المواد الحافظة مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو الجلسرين.

يتم تقسيم حبيبات العينة المُعاد تسييلها إلى مواد تبريد من مادة البولي بروبيلين مثلشركة سوتشو آيس الطبية الحيوية قوارير التخزين المبردة.

من المهم عدم الإفراط في ملء عبوات التبريد لأن ذلك سيزيد من خطر التشقق وإمكانية إطلاق المحتويات (1).

معدل التجميد المتحكم فيه

بشكل عام، يتم استخدام معدل تجميد بطيء يتم التحكم فيه من أجل الحفظ بالتبريد الناجح للخلايا.

بعد تقسيم العينات إلى قوارير مبردة، يتم وضعها على ثلج رطب أو في ثلاجة بدرجة حرارة 4 درجات مئوية وتبدأ عملية التجميد خلال 5 دقائق. كدليل عام، يتم تبريد الخلايا بمعدل -1 إلى -3 في الدقيقة (2). يتم تحقيق ذلك باستخدام مبرد قابل للبرمجة أو عن طريق وضع قوارير في صندوق معزول يوضع في مجمد بمعدل تحكم يتراوح بين -70 درجة مئوية إلى -90 درجة مئوية.

نقل إلى النيتروجين السائل

يتم بعد ذلك نقل القوارير المبردة المجمدة إلى خزان النيتروجين السائل لفترات غير محددة بشرط الحفاظ على درجة حرارة أقل من -135 درجة مئوية.

يمكن الحصول على درجات الحرارة المنخفضة للغاية هذه عن طريق الغمر في النيتروجين السائل أو البخاري.

مرحلة السائل أو البخار؟

من المعروف أن التخزين في نيتروجين الطور السائل يحافظ على درجة الحرارة الباردة بثبات مطلق، ولكن لا يوصى به غالبًا للأسباب التالية:

• الحاجة إلى كميات كبيرة (عمق) من النيتروجين السائل وهو خطر محتمل. الحروق أو الاختناق بسبب هذا يشكل خطرا حقيقيا.
• حالات موثقة من التلوث المتبادل عن طريق العوامل المعدية مثل الرشاشيات والتهاب الكبد B والانتشار الفيروسي عبر وسط النيتروجين السائل (2،3)
• احتمالية تسرب النتروجين السائل إلى القنينات أثناء الغمر. عند إخراجه من التخزين وتسخينه إلى درجة حرارة الغرفة، يتوسع النيتروجين بسرعة. ونتيجة لذلك، قد تتحطم القارورة عند إزالتها من تخزين النيتروجين السائل، مما يخلق خطرا من كل من الحطام المتطاير والتعرض للمحتويات (1، 4).

ولهذه الأسباب، يكون التخزين بدرجة حرارة منخفضة للغاية هو الأكثر شيوعًا في نيتروجين مرحلة البخار. عندما يجب تخزين العينات في الطور السائل، يجب استخدام أنابيب كريوفليكس متخصصة.

الجانب السلبي لمرحلة البخار هو أنه يمكن أن يحدث تدرج عمودي في درجة الحرارة مما يؤدي إلى تقلبات في درجات الحرارة بين -135 درجة مئوية و -190 درجة مئوية. وهذا يتطلب مراقبة دقيقة ومجتهدة لمستويات النيتروجين السائل والتغيرات في درجات الحرارة (5).

توصي العديد من الشركات المصنعة بأن تكون أجهزة التبريد مناسبة للتخزين حتى -135 درجة مئوية أو للاستخدام في مرحلة البخار فقط.

ذوبان الخلايا المحفوظة بالتبريد

يعد إجراء الذوبان أمرًا مرهقًا بالنسبة للثقافة المجمدة، ويلزم التعامل والتقنية المناسبة لضمان السلامة المثلى للخلايا واستعادتها ووظائفها. سوف تعتمد بروتوكولات الذوبان الدقيقة على أنواع معينة من الخلايا. ومع ذلك، يعتبر الذوبان السريع معيارًا لما يلي:

• تقليل أي تأثير على الانتعاش الخلوي
• ساعد في تقليل وقت التعرض للمواد المذابة الموجودة في وسط التجميد
• تقليل أي ضرر بسبب إعادة بلورة الجليد

تُستخدم عادةً حمامات الماء أو حمامات الخرز أو الأدوات الآلية المتخصصة لإذابة العينات.

في أغلب الأحيان، يتم إذابة خط خلية واحد في كل مرة لمدة 1-2 دقيقة، عن طريق التدوير بلطف في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يتبقى القليل من الجليد في القارورة قبل غسلها في وسط نمو مُدفأ مسبقًا.

بالنسبة لبعض الخلايا، مثل أجنة الثدييات، يعد الاحترار البطيء ضروريًا لبقائها على قيد الحياة.

أصبحت الخلايا الآن جاهزة لزراعة الخلايا، أو عزل الخلايا، أو في حالة الخلايا الجذعية المكونة للدم - دراسات الجدوى لضمان سلامة الخلايا الجذعية المانحة قبل العلاج النخاعي.

من الممارسات العادية أخذ قسامات صغيرة من العينة المغسولة مسبقًا المستخدمة لإجراء تعداد الخلايا لتحديد تركيزات الخلايا للطلاء في الثقافة. يمكنك بعد ذلك تقييم نتائج إجراءات عزل الخلايا وتحديد صلاحية الخلية.

أفضل الممارسات لتخزين Cryovials

يعتمد الحفظ بالتبريد الناجح للعينات المخزنة في أجهزة التبريد على العديد من العناصر في البروتوكول بما في ذلك التخزين السليم وحفظ السجلات.

• تقسيم الخلايا بين مواقع التخزين- إذا سمحت الأحجام، قم بتقسيم الخلايا بين القنينات وتخزينها في مواقع منفصلة لتقليل مخاطر فقدان العينة بسبب فشل المعدات.
• منع التلوث المتبادل– اختر قوارير المبردة المعقمة أو الأوتوكلاف ذات الاستخدام الواحد قبل الاستخدام اللاحق
• استخدم قوارير ذات حجم مناسب لخلاياك– تأتي القوارير بأحجام تتراوح بين 1 إلى 5 مل. تجنب الإفراط في ملء القوارير لتقليل خطر التشقق.
• حدد قوارير المبردة الداخلية أو الخارجية مترابطة– توصي بعض الجامعات بالقوارير الملولبة داخليًا لإجراءات السلامة – ويمكنها أيضًا منع التلوث أثناء التعبئة أو عند تخزينها في النيتروجين السائل.
• منع التسرب- استخدم الأختام ثنائية الحقن المصبوبة في الغطاء اللولبي أو الحلقات الدائرية لمنع التسرب والتلوث.
• استخدم الرموز الشريطية ثنائية الأبعاد وقوارير الملصقات- لضمان إمكانية التتبع، تتيح القوارير ذات المساحات الكبيرة للكتابة وضع علامة مناسبة على كل قارورة. يمكن أن تساعد الرموز الشريطية ثنائية الأبعاد في إدارة التخزين وحفظ السجلات. تعتبر القبعات المرمزة بالألوان مفيدة لتسهيل التعرف عليها.
• صيانة التخزين الكافية- لضمان عدم فقدان الخلايا، يجب على أوعية التخزين مراقبة درجة الحرارة ومستويات النيتروجين السائل باستمرار. يجب تركيب أجهزة الإنذار لتنبيه المستخدمين بالأخطاء.

احتياطات السلامة

أصبح النيتروجين السائل ممارسة شائعة في الأبحاث الحديثة ولكنه يحمل خطر الإصابة الخطيرة إذا تم استخدامه بشكل غير صحيح.

يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) لتقليل مخاطر قضمة الصقيع والحروق والحوادث الضارة الأخرى عند التعامل مع النيتروجين السائل. يرتدي

• القفازات المبردة
• معطف المختبر
• درع كامل للوجه مقاوم للصدمات ويغطي الرقبة أيضًا
• أحذية مغلقة عند الأصابع
• ساحة بلاستيكية مقاومة للرذاذ

يجب وضع ثلاجات النيتروجين السائل في مناطق جيدة التهوية لتقليل خطر الاختناق - حيث يتبخر النيتروجين المتسرب ويزيح الأكسجين الجوي. يجب أن تحتوي المتاجر كبيرة الحجم على أنظمة إنذار منخفضة الأكسجين.

يعد العمل في أزواج عند التعامل مع النيتروجين السائل أمرًا مثاليًا ويجب حظر استخدامه خارج ساعات العمل العادية.

Cryovials لدعم سير العمل الخاص بك

تقدم شركة Suzhou Ace Biomedical مجموعة واسعة من المنتجات التي تلبي احتياجات الحفظ بالتبريد لأنواع مختلفة من الخلايا. تشتمل المحفظة على مجموعة من الأنابيب بالإضافة إلى مجموعة من أجهزة التبريد المعقمة.

لدينا كريوفيالز هي:

• غطاء لولبي للمختبر 0.5 مل 1.5 مل 2.0 مل قارورة كريوفيال المبردة مخروطية الشكل مع حشية

  ● مواصفات 0.5 مل، 1.5 مل، 2.0 مل، مع تنورة أو بدون تنورة
  ● يتوفر تصميم مخروطي أو قائم بذاته، معقم أو غير معقم
  ● أنابيب ذات غطاء لولبي مصنوعة من مادة البولي بروبيلين الطبية
  ● يمكن تجميد وإذابة قوارير PP Cryotub بشكل متكرر
  ● تصميم الغطاء الخارجي يمكن أن يقلل من احتمالية التلوث أثناء معالجة العينة.
  ● أنابيب تبريد ذات غطاء لولبي، خيوط لولبية عالمية للاستخدام
  ● تناسب الأنابيب معظم الدوارات الشائعة
  ● تتناسب الأنابيب الدائرية للأنبوب المبرد مع صناديق التجميد القياسية مقاس 1 بوصة و2 بوصة و48 بئرًا و81 بئرًا و96 بئرًا و100 بئرًا
  ● قابل للتعقيم حتى 121 درجة مئوية ويمكن تجميده حتى -86 درجة مئوية

  الجزء رقم	مادة	مقدار	كابلون	أجهزة الكمبيوتر /شنطة	حقائب/حالة
  ACT05-BL-N	PP	0.5 مل	الأسود والأصفر والأزرق والأحمر والأرجواني والأبيض	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5 مل	الأسود والأصفر والأزرق والأحمر والأرجواني والأبيض	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5 مل	الأسود والأصفر والأزرق والأحمر والأرجواني والأبيض	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0 مل	الأسود والأصفر والأزرق والأحمر والأرجواني والأبيض	500	10