على الرغم من نظريًا ، فإن جزيء واحد من القالب سيكون كافياً ، عادة ما يتم استخدام كميات أكبر بكثير من الحمض النووي ل PCR الكلاسيكي ، على سبيل المثال ، ما يصل إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي للثدييات الجينومية وأقل من 1 Pg من الحمض النووي البلازميد. يعتمد المبلغ الأمثل إلى حد كبير على عدد نسخ التسلسل المستهدف ، وكذلك على تعقيده.
إذا تم استخدام قالب قليل جدًا ، فستكون هناك حاجة إلى زيادة مماثلة في عدد دورات التضخيم للحصول على كمية كافية من المنتج. لا يتميز بوليميريز Taq الذي يتم استخدامه في معظم تجارب PCR بوظيفة تصحيح (3′-5 ′ exinuclease نشاط) ؛ وبالتالي ، لا يمكن تصحيح الأخطاء التي تحدث أثناء التضخيم. كلما ارتفع عدد الدورات ، كلما كان تضخيم المنتج المعيب أكثر انتشارًا. إذا ، من ناحية أخرى ، تكون كمية القالب مرتفعة للغاية ، فإن احتمال أن يكون الاشعال الصلب إلى تسلسلات أخرى (لا مائة في المائة مجانية) ، وكذلك تكوين داعش التمهيدي ، سيؤدي إلى زيادة تضخيمها منتجات ثانوية. في كثير من الحالات ، يتم عزل الحمض النووي عن ثقافات الخلايا أو من الكائنات الحية الدقيقة ويستخدم لاحقًا كقالب PCR. بعد التنقية ، من الضروري تحديد تركيز الحمض النووي ليكون قادرًا على تحديد الحجم المطلوب لإعداد PCR. في حين أن agarose هلام الكهربائي قد يعمل على توفير تقدير ، فإن هذه الطريقة بعيدة عن الدقة. تم إنشاء قياس الطيف UV-VIS كمعيار ذهبي لتقدير الأحماض النووية ؛ هذه الطريقة المباشرة والسهلة والسريعة تقيس امتصاص العينة عند 260 نانومتر ، ويتم حساب التركيز بمساعدة عامل التحويل.
إذا كان تركيز الحمض النووي منخفضًا جدًا ، ومع ذلك (<1 ميكروغرام/مل DSDNA) ، أو إذا كان ملوثًا بالمواد التي تمتص أيضًا في نطاق 260 نانومتر (مثل RNA ، البروتين ، الأملاح) ، ستصل هذه الطريقة إلى حدودها. في حالة التركيزات المنخفضة للغاية ، ستصبح القراءات قريبًا غير دقيقة للغاية بحيث لا يمكن استخدامها ، وستؤدي الملوثات إلى المبالغة في تقدير القيمة الفعلية (الهائلة في بعض الأحيان). في هذه الحالة ، قد يقدم القياس الكمي باستخدام مضان بديلاً. تعتمد هذه التقنية على استخدام صبغة الفلورسنت التي ترتبط بالتحديد بـ dsDNA فقط المركب الذي يشتمل على الحمض النووي والصبغة متحمسًا للضوء ، وسيؤدي ذلك لاحقًا إلى انبعاثات ذات طول موجي أعلى قليلاً. هنا ، تتناسب شدة إشارة الفلورسنت مع كمية الحمض النووي ، ولتحديد التركيز الذي يتم تقييمه فيما يتعلق بمنحنى قياسي. تعتمد مزايا هذه الطريقة على خصوصية الرابطة ، والتي تستبعد التأثيرات الخارجية التي أدخلتها التلوث ، وكذلك على القدرة الناتجة على اكتشاف تركيزات منخفضة للغاية من الحمض النووي. يعتمد ملاءمة أي من الطريقة بشكل أساسي على تركيز العينة والنقاء ؛ في كثير من الحالات ، قد يكون من المستحسن تطبيق كلتا الطريقتين بالتوازي.
وقت النشر: نوفمبر -30-2022