Bekendstelling
Wat is nukleïensuur ekstraksie?
In die baie eenvoudigste terme is die ekstraksie van nukleïensuur die verwydering van die RNA en/of DNA uit 'n monster en al die oormaat wat nie nodig is nie. Die proses van ekstraksie isoleer die nukleïensure uit 'n monster en lewer dit in die vorm van 'n gekonsentreerde eluaat, vry van verdunningsmiddels en kontaminante wat enige stroomaf -toepassings kan beïnvloed.
Toepassings van nukleïensuur ekstraksie
Gesuiwerde nukleïensure word in 'n oorvloed van verskillende toepassings gebruik, wat wissel oor verskillende industrieë. Gesondheidsorg is miskien die gebied waar dit die meeste gebruik word, met gesuiwerde RNA en DNA wat benodig word vir 'n hele aantal verskillende toetsdoeleindes.
Toepassings van nukleïensuurekstraksie in gesondheidsorg sluit in:
- Volgende generasie volgorde (NGS)
- Amplification-gebaseerde SNP-genotipering
- Array-gebaseerde genotipering
- Beperkingsensiemvertering
- Ontledings met behulp van modifiserende ensieme (bv. Ligering en kloning)
Daar is ook ander velde buite gesondheidsorg waar nukleïensuurontginning gebruik word, insluitend maar nie beperk nie tot vaderskapstoetsing, forensiese en genomika.
'N Kort geskiedenis van nukleïensuur ekstraksie
DNA -ekstraksieDatums is 'n lang pad, met die eerste bekende isolasie wat in 1869 deur 'n Switserse dokter met die naam Friedrich Miescher uitgevoer is. Miescher het gehoop om die fundamentele lewensbeginsels op te los deur die chemiese samestelling van selle te bepaal. Nadat hy met limfosiete misluk het, kon hy 'n ru -neerslag van DNA verkry van leukosiete wat in pus op weggegooide verbande aangetref word. Hy het dit gedoen deur suur en dan alkali by die sel te voeg om die sitoplasma van die sel te verlaat, en het daarna 'n protokol ontwikkel om die DNA van die ander proteïene te skei.
Na die baanbrekende navorsing van Miescher, het baie ander wetenskaplikes voortgegaan om tegnieke te bevorder en te ontwikkel om DNA te isoleer en te suiwer. Edwin Joseph Cohn, 'n proteïenwetenskaplike het baie tegnieke vir proteïen suiwering tydens die Tweede Wêreldoorlog ontwikkel. Hy was verantwoordelik vir die isolering van die serumalbumienfraksie van bloedplasma, wat belangrik is om die osmotiese druk in die bloedvate te handhaaf. Dit was baie belangrik om soldate lewendig te hou.
In 1953 het Francis Crick, saam met Rosalind Franklin en James Watson, die struktuur van DNA bepaal, wat toon dat dit bestaan uit twee dele lang kettings van nukleïensuurnukleotiede. Hierdie deurbraak-ontdekking het die weg gebaan vir Meselson en Stahl, wat 'n digtheidsgradiënt-sentrifugasieprotokol kon ontwikkel om DNA van E. coli-bakterieë te isoleer, aangesien hulle die semi-konserwatiewe replikasie van DNA tydens hul eksperiment van 1958 getoon het.
Tegnieke van nukleïensuur ekstraksie
Wat is die vier stadiums van DNA -ekstraksie?
Alle ekstraksiemetodes kom neer op dieselfde fundamentele stappe.
Selontwrigting. Hierdie stadium, ook bekend as sellysis, behels die afbreek van die selwand en/of die selmembraan, om die intra-sellulêre vloeistowwe wat die nukleïensure van belang bevat, vry te stel.
Verwydering van ongewenste puin. Dit sluit membraanlipiede, proteïene en ander ongewenste nukleïensure in wat die stroomaf -toepassings kan beïnvloed.
Isolasie. Daar is 'n aantal verskillende maniere om die nukleïensure van belang te isoleer van die skoongemaakte lysaat wat u geskep het, wat tussen twee hoofkategorieë val: oplossing gebaseer of vaste toestand (sien volgende afdeling).
Konsentrasie. Nadat die nukleïensure van alle ander kontaminante en verdunningsmiddels geïsoleer is, word dit in 'n hoogs gekonsentreerde eluaat aangebied.
Die twee soorte ekstraksie
Daar is twee soorte nukleïensuur -ekstraksie -gebaseerde metodes en vaste toestandmetodes. Die oplossinggebaseerde metode staan ook bekend as die chemiese ekstraksiemetode, aangesien dit die gebruik van chemikalieë behels om die sel af te breek en toegang tot die nukleïese materiaal te kry. Dit kan gebruik word van organiese verbindings soos fenol en chloroform, of die minder skadelike en dus meer aanbevole anorganiese verbindings soos proteïnase K of silikagel.
Voorbeelde van verskillende chemiese ekstraksiemetodes om 'n sel af te breek, sluit in:
- Osmotiese skeuring van membraan
- Ensimatiese vertering van die selwand
- Oplosing van membraan
- Met skoonmaakmiddels
- Met alkali -behandeling
Vaste toestandstegnieke, ook bekend as meganiese metodes, behels die ontginning van hoe DNA in wisselwerking is met 'n soliede substraat. Deur 'n kraal of molekule te kies waarop die DNA sal bind, maar die analiet nie, is dit moontlik om die twee te skei. Voorbeelde van vaste-fase-ekstraksietegnieke, insluitend die gebruik van silika en magnetiese krale.
Magnetiese kraalekstraksie verduidelik
Die magnetiese kraalekstraksiemetode
Die potensiaal vir ekstraksie met behulp van magnetiese krale is eers erken in 'n Amerikaanse patent wat deur Trevor Hawkins ingedien is vir die Whitehead Institute Research Institution. Hierdie patent het erken dat dit moontlik was om genetiese materiaal te onttrek deur dit aan 'n soliede ondersteuningsdraer te bind, wat 'n magnetiese kraal kan wees. Die beginsel is dat u 'n hoogs gefunksionaliseerde magnetiese kraal gebruik waarop die genetiese materiaal sal bind, wat dan van die supernatant geskei kan word deur 'n magnetiese krag aan die buitekant van die vaartuig aan te pas wat die monster vashou.
Waarom magnetiese kraalekstraksie gebruik?
Magnetiese kraalekstraksietegnologie word al hoe meer algemeen as gevolg van die potensiaal wat dit inhou vir vinnige en doeltreffende ekstraksieprosedures. In onlangse tye was daar ontwikkelings van hoogs gefunksionaliseerde magnetiese krale met geskikte bufferstelsels, wat die outomatisering van nukleïensuur-ekstraksie moontlik gemaak het en 'n werkvloei wat baie hulpbronlig en koste-effektief is. Magnetiese kraalekstraksiemetodes behels ook nie die sentrifugasietappe wat skuifkragte kan veroorsaak wat langer stukke DNA opbreek nie. Dit beteken dat langer dele van DNA ongeskonde bly, wat belangrik is in genomika -toetsing.
Postyd: Nov-25-2022