Alhoewel in teorie, een molekule van die sjabloon voldoende sou wees, word aansienlik groter hoeveelhede DNA tipies vir 'n klassieke PCR gebruik, byvoorbeeld tot 1 µg genomiese soogdier-DNS en so min as 1 pg plasmied-DNA. Die optimale hoeveelheid hang grootliks af van die aantal kopieë van die teikenvolgorde, sowel as die kompleksiteit daarvan.
Indien baie min sjabloon gebruik word, sal 'n ooreenstemmende toename in die aantal amplifikasiesiklusse nodig wees om 'n voldoende hoeveelheid produk te verkry. 'n Taq-polimerase wat vir die meeste PKR-eksperimente gebruik word, beskik nie oor 'n regstellingsfunksie nie (3'-5' eksonuklease-aktiwiteit); dus kan foute wat tydens amplifikasie voorkom nie reggestel word nie. Hoe hoër die aantal siklusse, hoe meer algemeen sal die versterking van gebrekkige produk wees. As, aan die ander kant, die hoeveelheid templaat te hoog is, sal die waarskynlikheid dat primers gloei na ander (nie honderd persent komplimentêre) volgordes, sowel as die vorming van primer dimere, toeneem, wat sal lei tot die amplifikasie van neweprodukte. In baie gevalle word DNA uit selkulture of van mikroörganismes geïsoleer en daarna as 'n PCR-sjabloon gebruik. Na suiwering is dit nodig om die konsentrasie van die DNA te bepaal om die volume te kan definieer wat benodig word vir die PCR-opstelling. Alhoewel agarosegelelektroforese kan dien om 'n skatting te verskaf, is hierdie metode ver van akkuraat. UV-Vis spektrofotometrie is vasgestel as die goue standaard vir die kwantifisering van nukleïensure; hierdie direkte en dus maklike en vinnige metode meet absorpsie van die monster by 260 nm, en konsentrasie word met behulp van 'n omskakelingsfaktor bereken.
As die DNS-konsentrasie egter baie laag is (< 1 µg/ml dsDNA), of as dit besmet is met stowwe wat ook in die 260 nm-reeks absorbeer (bv. RNS, proteïen, soute), sal hierdie metode sy beperkings bereik. In die geval van baie lae konsentrasies sal die lesings gou te onakkuraat word om van nut te wees, en besoedeling sal lei tot (soms enorme) oorskatting van die werklike waarde. In hierdie geval kan kwantifisering deur gebruik te maak van fluoressensie 'n alternatief bied. Hierdie tegniek is gebaseer op die gebruik van 'n fluoresserende kleurstof wat spesifiek aan dsDNA bind, slegs die kompleks wat nukleïensuur en kleurstof bevat word deur die lig opgewek, en dit sal daarna lig van 'n effens hoër golflengte uitstraal. Hier is die intensiteit van die fluoresserende sein eweredig aan die hoeveelheid DNA, en vir die bepaling van die konsentrasie word dit geëvalueer in verhouding tot 'n standaardkurwe. Die voordele van hierdie metode berus op die spesifisiteit van die binding, wat die eksterne invloede wat deur kontaminasie veroorsaak word, uitsluit, sowel as op die gevolglike vermoë om baie lae konsentrasies DNA op te spoor. Die geskiktheid van enige metode hang hoofsaaklik af van monsterkonsentrasie en suiwerheid; in baie gevalle kan dit selfs raadsaam wees om beide metodes parallel toe te pas.
Pos tyd: Nov-30-2022